动物组织中特布他林、克伦特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺残留量的测定 气相色谱-质谱法
1 范围
本标准规定了气相色谱－质谱（GC－MS）法测定动物组织中特布他林、克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺等4种β2-兴奋剂残留量的方法。
本标准适用于畜禽肌肉、肝脏、肺、肾等组织中特布他林、克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺等4种β2-兴奋剂残留量的测定。
本方法检测限为：特布他林1.0μg/kg、克伦特罗2.0μg/kg、沙丁胺醇1.0μg/kg、莱克多巴胺2.0μg/kg。
2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
3 方法原理
试样加入内标物后，用甲醇提取和离子交换固相萃取柱净化，氮气吹干，与N，O-双三甲基硅烷三氟乙酰胺（BSTFA）进行衍生化反应，于气相色谱－质谱仪上进行测定。内标法定量。
4 试剂和溶液
所有试剂，如未注明规格，均指分析纯；所有实验室用水为去离子水，应符合GB/T 6682二级水的规定。
4.1 甲醇
4.2 乙酸乙酯：色谱纯
4.3 氨水
4.4 盐酸
4.5 0.2mol/L盐酸溶液：取盐酸（4.4）9mL，加水至500mL，摇匀，即得。
4.6 30mmol/L盐酸溶液：取0.2mol/L盐酸溶液（4.5）15mL，加水至100mL，摇匀，即得。
4.7 无水硫酸钠：450℃干燥12h，备用。
4.8 正己烷
4.9 甲苯：色谱纯
4.10 衍生剂：N，O-双三甲基硅烷三氟乙酰胺（BSTFA）
4.11 4％氨水/乙酸乙酯溶液：取氨水（4.3）4mL加乙酸乙酯（4.2）至100mL，超声15min，充分混匀，即配即用。
4.12 SLS阳离子交换固相萃取柱1)：每根柱填料量为400mg，柱体积5mL。
4.13 标准品：特布他林、克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺，纯度≥98%。
4.14 同位素内标物：D9-克伦特罗100μg/mL，D3-沙丁胺醇100μg/mL。
4.15 β2-兴奋剂标准储备液：取特布他林、克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺标准品（4.13）10mg，
1)SLS阳离子交换固相萃取柱是由杭州富裕科技服务有限公司提供的产品的商品名称，给出这一信息是为了给本标准的使用者提供方便，而不是主管部门对这一产品的认可。
精密称定，分别置100mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，其浓度均为0.1mg/mL，置-20℃以下冰箱中保存，有效期为6个月。
4.16 β2-兴奋剂混合标准工作液：分别准确吸取适量的β2-兴奋剂标准储备液（4.15）于同一容量瓶中，用甲醇稀释成含特布他林、克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺均为1.0μg/mL的混合标准工作液，置4℃～8℃冰箱中保存，有效期为1个月。
4.17 β2-兴奋剂内标工作液：分别准确吸取适量的β2-兴奋剂同位素内标物（4.14）于同一容量瓶中，用甲醇稀释成含D9-克伦特罗、D3-沙丁胺醇均为1.0μg/mL混合内标工作液，置4℃～8℃冰箱中保存，有效期为1个月。
5 仪器设备
5.1 气相色谱-质谱仪：配有电子轰击（EI）源。
5.2 离心机：最大转速9000r/min或以上。
5.3 组织绞碎机。
5.4 组织匀浆机：最大转速10000r/min或以上。
5.5 分液漏斗：125 mL。
5.6 具塞玻璃试管：5mL，10mL。
5.7 涡旋混合器。
5.8 分析天平：感量0.00001g，0.01g。
5.9 超声波清洗器。
5.10 离心管：50mL，10mL。
5.11 氮吹仪。
5.12 移液器：量程20μL～200μL，100μL～1000μL。
6 分析步骤
6.1 试样制备
取有代表性的样品，经绞碎后，保存于-20℃冰箱中，备用。
6.2 试样提取
称取试样5g（精确到0.01g），置于50mL离心管中，加β2-兴奋剂内标工作液（4.17）50μL；加甲醇20mL，10000r/min以上均质60s，加盖，于60℃超声波清洗器中超声20min；取出离心管，冷却后8000r/min离心10min，倾出上清液至分液漏斗中，另取甲醇10mL重复提取一次，合并上清液；加正己烷20mL脱脂一次，分离甲醇相，在60℃下氮气吹至2mL以下；加0.2mol/L盐酸（4.5）3mL，充分混匀后，在9000r/min离心10min，分出上清液，备用。
6.3 试样净化
依次用甲醇5mL、水5mL、30mmoL/L盐酸溶液（4.6）5mL润洗阳离子交换固相萃取柱（4.12），取6.2上清液过柱，弃去流出液，并依次用水5mL和甲醇5mL淋洗柱子，抽干；用4％氨水/乙酸乙酯溶液（4.11）10mL洗脱，收集洗脱液，经无水硫酸钠（4.7）脱水，50℃氮气吹干；残余物中加乙酸乙酯5mL，置于超声波清洗器中超声5min，5000r/min离心5min，分出上清液至5mL具塞玻璃试管中，50℃氮吹至干，吹干物备用。
6.4 衍生化
吹干物加入甲苯（4.9）100μL和衍生剂（4.10）100μL，加塞后于涡旋混合器充分混匀，在80℃±5℃的烘箱中恒温衍生60min，氮气吹干，加甲苯0.5mL溶解供GC-MS分析。
另取β2-兴奋剂混合标准工作液（4.16）适量，加β2-兴奋剂内标工作液（4.17）50μL，加乙酸乙酯5mL后，氮气吹干，与样品同步进行衍生化。
6.5 仪器测定
6.5.1色谱条件
色谱柱：5%苯基甲基聚硅氧烷弹性石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25μm)，或具同等性能的色谱柱；
进样口温度：280℃；
柱温程序：初温120℃，保持3 min，然后以10℃／min升至230℃，保持5min，再以10℃／min升至280℃保持3min；
载气：高纯氦气（99.999%）；
流速：1.0mL/min，不分流进样；
进样量：2.0μL。
6.5.2质谱条件
EI源：源温230℃；
电子能量：70eV；
接口温度：280℃；
电子倍增器电压：高于调谐电压200V；
质量扫描范围：30～550U；
溶剂延迟：10min ；
选择离子监测方式（SIM）。
监测离子（m/z）：特布他林86、356*、426；克伦特罗86*、262、243；沙丁胺醇369*、440、207；莱克多巴胺179、250*、502；D9-克伦特罗95*、262；D3-沙丁胺醇372*、443；其中带*离子为定量离子，分三段进行采集，特布他林、克伦特罗、D9-克伦特罗为第Ⅰ阶段，沙丁胺醇、D3-沙丁胺醇为第Ⅱ阶段莱克多巴胺第Ⅲ阶段，详见表1。在上述色谱条件下，标准物质总离子流图参见附录A；标准物质质谱图参见附录B。
表1 4种β2-兴奋剂和2种内标物的保留时间和质谱条件
|
药物名称 |
采集阶段 |
选择离子（m/z） |
定量离子（m/z） |
|
特布他林 |
Ⅰ |
356，86，426 |
356 |
|
克伦特罗 |
Ⅰ |
86, 243, 262 |
86 |
|
D9-克伦特罗 |
Ⅰ |
95，262 |
95 |
|
沙丁胺醇 |
Ⅱ |
369，207，440 |
369 |
|
D3-沙丁胺醇 |
Ⅱ |
372，443 |
372 |
|
莱克多巴胺 |
Ⅲ |
250, 179, 502 |
250 |
6.5.3气相色谱-质谱测定
6.5.3.1定性方法
在相同试验条件下，样品中待测物与同时检测的标准物质的保留时间之差在±2s之内，并且所选择的离子相对丰度比符合表2要求，可判定为样品中存在该药物残留。
表2 试样离子丰度比与标准物质离子丰度比的允许偏差范围
|
占基峰相对丰度（％） |
最大允许偏差（％） |
|
＞50 |
±10 |
|
＞20～50 |
±15 |
|
＞10～20 |
±20 |
|
≤10 |
±50 |
6.5.3.2定量方法
以峰面积按内标法进行单点或多点校准定量，标准工作液和样品液中药物响应值均应在仪器检测线性范围内。
以D9-克伦特罗（m/z 95）作为计算克伦特罗（m/z 86）和莱克多巴胺（m/z 250）浓度的内标物，以D3-沙丁胺醇（m/z 372）作为计算特布他林（m/z 356）和沙丁胺醇（m/z 369）浓度的内标物。
7 结果计算
按内标法单点或多点校准计算试样中4种β2-兴奋剂的含量。
试样中4种β2-兴奋剂的含量按下式计算：
A
X＝ ×D
M
式中：X——试样中β2-兴奋剂各组分的含量，μg/kg；
A——试样色谱峰对应的β2-兴奋剂各组分的质量，ng；
M——试样质量，g；
D——稀释倍数；
计算结果保留3位有效数字。
8 精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值与算术平均值之比应不大于20％。
9 回收率
本方法回收率在60％～130％之间。
图A.1 β2-兴奋剂和内标物衍生物的总离子流（TIC）图
1. 特布他林（13.09min）, 2. D9-克伦特罗（13.41min）, 3. 克伦特罗（13.47min），
4.沙丁胺醇（13.83min）, 5.D3-沙丁胺醇（13.82min）, 6.莱克多巴胺（24.15min）
附录B
(资料性附录)
标准物质质谱图
图B.1 β2-兴奋剂和内标物衍生物的质谱图（EI源）
A. D9-克伦特罗，B. D3-沙丁胺醇，C.沙丁胺醇，D.克伦特罗，E.莱克多巴胺，F.特布他林
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